德运康明创新性技术平台”基于数字微流控的样品制备平台Digital-WGS”

发布时间： 2020-12-25

近年来，单细胞测序技术在生命科学领域刮起了一阵变革之风，以细胞群体为研究对象的方法逐步升级为基于单细胞的技术路线。它区别于以往测量细胞群体的平均状态的方式，能够评估单个细胞的基因组，转录组或蛋白质组信息，在癌症生物学、神经科学、干细胞研究、免疫学等一系列研究中得到了广泛的应用。

进行单细胞分析的第一步是单细胞的分离，这在过去极为困难耗时，但是微流控技术的发展为这个难题提供了完美的解决方案。通过液滴微流控技术将单个细胞包裹在相对独立的微液滴中，或是将细胞限制在与细胞大小接近的微孔/微池/微通道中，不仅能实现单细胞的分离，而且能获得较高的通量，只要一次实验便能获得成千上万个单细胞的数据。其中，基于液滴单细胞系统的公司以美国10x Genomics为代表，而基于微孔/微池的设计则以BD公司为代表。

基于微孔/微池的微流控装置通常由多达数万乃至数十万的微孔/微池阵列组成，细胞和微球按照泊松分布随机沉降分散至各个微孔/微池中，再利用薄膜或油进行物理隔绝以保证每个细胞都在独立密闭的空间内进行试验。这种装置的优点是芯片的设计和制作简单，通量相对较高，但其问题在于，细胞和微球的沉降是随机的，沉降结果不够稳定，而且微孔/微池是固定的，其操作自由度较低，自动化程度较低。基于液滴的系统也可以利用相对简单的芯片设计，快速高通量地形成单细胞微反应器。在液滴方案中，细胞的分隔不是通过芯片上的物理结构，而且通过一种与水不互溶的连续相。但是在这个体系中，为了减少液滴中双细胞/多细胞的比例，需要调整细胞和微球的浓度，这产生了很多无效液滴，造成了浪费。

图1. 基于液滴(左)和基于微池(右)的单细胞反应器

为了区分不同的细胞，这些微流控技术通常都需要利用携带核酸编码(barcode)的微球对细胞进行标记，这限制了该技术只能对末端进行测序，而无法实现全长测序。同时，这类高通量的方法通常对输入的细胞数有要求，一般都需要数万乃至数十万的细胞，这显然不适用于一些材料有限的珍贵样本。另外，这类微流控平台往往只能实现单一组学的测序，而现在越来越多的研究需要基因组、转录组、蛋白组中两种或三种组学同时检测，这也限制了这类平台的应用。

数字微流控(Digital microfluidics, DMF)是另一种芯片实验室平台，它利用电润湿的技术控制操纵纳升级的液滴进行移动、混合。电润湿的原理是通过电压变化调节芯片表面的湿润度，在不同条件下液滴呈现收缩或扩张，当在芯片上固定电极阵列，便可通过电压的变化驱动液滴。利用编程控制电信号变化，就可以实现液滴自动化控制。数字微流控系统还可以集成热，磁和光学组件，以执行诸如PCR，基于微球的操作和定量等过程。这样可以保护珍贵的样品材料，并大大减少了人为操作错误的可能性。

德运康明开发了基于数字微流控的样品制备平台Digital-WGS，该平台可用于一体化、全自动的高性能单细胞全基因组测序，目前该平台相关发明已获得专利授权。通过在芯片上构建基于流体力学原理和局部表面润湿特性的微捕获结构，辅以蝶形捕获结构引导液滴内部流体流动，使单细胞在液滴移动过程中被精准地捕获于蝶形结构中，实现全自动的高效单细胞分离，对不同细胞类型、不同数目的细胞实现了超高效的自动化单细胞捕获。单细胞捕获完成后，可直接在芯片上进行单细胞裂解和全基因组扩增。扩增完成后，可以方便地取出产物进行后续的建库测序以及数据分析。

图2. Digital-WGS流程及芯片结构示意图

总结来说，数字微流控(DMF)解决了目前单细胞测序的两大痛点，一是单细胞的高效自动化分离，虽然利用液滴微流控技术已经使单细胞测序的通量达到上万个细胞，但是对于一些材料极其有限的珍惜样本，这些技术却无能为力，而一些手动的方法虽然可以实现，但对操作者要求高，而且效率偏低。第二个痛点是单细胞的有效扩增，由于单细胞含有的遗传物质是痕量的，这导致它极易在人工操作过程中因丢失、受污染、扩增偏差导致扩增失败，而在DMF芯片上，对细胞的所有操作均可在液滴中可控进行，减少了多步转移带来的风险。此外，DMF作为一个开放的平台，可以兼容任何方法，未来它可以方便地升级扩展为多组学同时检测的平台，这也为它带来了更广阔的应用前景。